7 семестр / Методичка - Химическая кинетика

Рисунок 7.5 Биосенсорная установка на основе кислородного

электрода

2. Для модификации кислородного электрода наносят 10 мкл суспензии фермента глюкозооксидазы на диализную мембрану (Sigma,

США) и фиксируют на электроде с помощью резинового кольца (рисунок

7.6).

110

Рисунок 7.6 Иммобилизация фермента на кислородном электроде с

применением диализной мембраны: 1 – платиновый электрод; 2 – серебряная проволока; 3 – раствор фермента; 4 – газопроницаемая мембрана; 5 – диализная мембрана; 6 – резиновое кольцо фиксации; 7 – кислородный электрод с иммобилизованным ферментом ГО (или бактериями P.yeei).

1. Управление прибором и обработка результатов измерений проводится с помощью программы «EXP2PR», установленной на персональном компьютере.

Рисунок 7.7. Окно программы «EXP2PR»

111

2.В кювету вносят 4 см3 буферного раствора и погружают в нее электрод с иммобилизованным ферментом (или бактериями P.yeei).

Дожидаются установления стационарного содержания растворенного кислорода (от 4 до 8 мг/дм3).

3.Во вкладке программы «Таблица» выставляют интервал записи 1 секунду, нажимают галочку «Запись интервал» и вводят в кювету раствор глюкозы. При введении субстрата в измерительную ячейку фермент окисляет его, в приэлектродном пространстве снижается концентрация кислорода, что регистрируется с помощью датчика растворенного кислорода, подключенного к анализатору «Эксперт – 001».

Рисунок. 7.8. Вкладка «Таблица» программы «EXP2PR»

4.После окончания измерения кювету снова промывают буферным раствором, до восстановления начальных параметров (содержание кислорода).

5.После снятия ответа данные копируют в программу Exel и

проводят их обсчет, выбирая максимальный тангенс угла наклона

112

(коэффициент при x в уравнении прямой). Измеряемым параметром

(ответом биосенсора) является максимальная скорость (по модулю) изменения выходного сигнала биосенсора при добавлении субстрата (рисунок 7.9)

Рисунок 7.9 Ответ биосенсора (R) при добавлении субстрата

6.	Данные измерений заносят в таблицу
№		Объем пробы	Концентрация	Скорость реакции (r),
		глюкозы, мкл	глюкозы в кювете	мг/ дм3с
			(S), моль/дм3
1		50
2		100
3		150
4		200
			113

5 300

6500

7700

11.По полученным экспериментальным и расчетным данным строят зависимость ответа биосенсора от концентрации глюкозы в кювете в программе SigmaPlot. Обрабатывают данную зависимость

гиперболической функцией.

Определяют константу Михаэлиса (КМ) (коэффициент b из уравнения гиперболы) и максимальную скорость ферментативной реакции (rmax) (коэффициент а из уравнения гиперболы) из вкладки «Report».

114

7. Строят график в программе Exel в двойных обратных координатах по методу Лайнуивера-Берка по данным таблицы

№	Концентрация		Скорость		1/S	1/r
	глюкозы	в	реакции	(r),
	кювете	(S),	мг/ дм3с
	моль/дм3
1
2
3
4
5
6
7

Данная зависимость также описывается уравнением прямой (y=ax+b). В случае отклонения от линейности при необходимости можно

удалить несколько точек, т.к. метод хорошо работает только в области малых значений переменных. Максимальная скорость (rmax)

ферментативной реакции соответствует обратной величине свободного члена уравнения (коэффициент b). Константа Михаэлиса может быть найдена как графически (-1/отсекаемый отрезок на оси х) (рисунок 7.3) ,

так и аналитически как произведение тангенса угла наклона прямой (коэффициент а в уравнении) на rmax.

115

8.		Строят график в программе Exel в обратных координатах по
методу Иди-Хофсти по данным таблицы
	№		Концентрация		Скорость	реакции	r/S
			глюкозы	в	(r), мг/ дм3с
			кювете	(S),
			моль/дм3
	1
	2
	3
	4
	5
	6
	7

Данная зависимость описывается уравнением прямой (y=ax+b), где константа Михаэлиса (Km) равна тангенсу угла наклона (коэффициент а), а максимальная скорость (rmax) соответствует коэффициент b (рисунок 7.4).

9. Проводят сравнение констант рассчитанных тремя способами и

делают вывод по работе

Контрольные вопросы

1.Ферментативная кинетика.

2.Физический смысл константы Михаэлиса. Что такое кажущаяся константа Михаэлиса?

3.Почему константа Михаэлиса является кинетическим параметром ферментативной реакций, а не равновесной константой?

116

4.Методы определения параметров уравнения Михаэлиса-

Ментен.

5.Суть метода Иди-Хофсти

6.Суть метода Лайнуивера-Берка

117

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №8. ФЕРМЕНТАТИВНАЯ КИНЕТИКА ОКИСЛЕНИЯ ГЛЮКОЗЫ В ПРИСУТСТВИИ ИНГИБИТОРА

Цель работы: выявить влияние обратимых ингибиторов на кинетику ферментативной реакции окисления глюкозы ферментом глюкозооксидазой (или бактериями).

Теоретические сведения

На активность всех ферментов могут влиять неспецифические факторы, такие как температура и рН. Кроме того, существуют вещества, которые в очень низких концентрациях повышают активность ферментов (активаторы), или, напротив, снижают ее (ингибиторы). Активаторы и ингибиторы могут действовать в активном центре или в удалённом от него, аллостерическом центре молекулы фермента.

Рассмотрим схему взаимодействия конкурентных и неконкурентных ингибиторов на фермент в присутствии субстрата (рисунок 8.1).

118

Рисунок 8.1. Сравнение конкурентного и неконкурентного ингибирования.

В общем случае влияние обратимо действующих ингибиторов на двухстадийную ферментативную реакцию может быть передано схемой (рисунок 8.2). В этой схеме предусмотрено взаимодействие ингибиторов (I) как со свободной формой фермента (E), так и с фермент-субстратным комплексом (ES).

Рисунок 8.2. Общая схема ингибирования, где: E – фермент;

S – субстрат;

ES – фермент-субстратный комплекс;

119